Группа системной биологии микоплазм

Микоплазмы – представители класса Молликут (Mollicutes). Это специализированная ветвь микроорганизмов, родственная грамм-положительным бактериям. Большинство Молликут – облигатные паразиты, хотя есть факультативные паразиты и комменсалы. Молликуты обладают рядом особенностей, в частности, их геномы сильно редуцированы и отсутствует клеточная стенка. Многие микоплазмы обладают уникальными механизмами подвижности, не встречающимися среди других групп бактерий.
Mycoplasma gallisepticum - возбудитель хронического респираторного заболевания птиц. M. gallisepticum является близким родственником патогенов человека – M. pneumonia, M. genitalium и представителей рода Ureaplasma, вследствие чего является удобным модельным объектом. M. gallisepticum – «классическая» микоплазма. Размер генома M. gallisepticum порядка 1 миллиона пар оснований. M. gallisepticum обладает специальным аппаратом прикрепления к клеткам хозяина – терминальной органеллой, аппаратом подвижности, устроенным по принципу многоножки. Интересная особенность M. gallisepticum – около 10% генома этой бактерии занимают кассеты с поверхностными антигенами. Эти белки выполняют двоякую роль – обеспечивают прикрепление M. gallisepticum к клеткам хозяина, и участвуют в уходе от иммунного ответа. Последнее происходит путём смены одного антигена из кассеты, на который организм хозяина выработал иммунный ответ, на другой. Механизм переключения остаётся до сих пор до конца непонятным.
Spiroplasma meliferum интересна тем, что её жизненный цикл проходит со сменой двух хозяев – пчёл и цветковых растений. Смена хозяина сопряжена со сменой физиологии и морфологии клетки. S. meliferum – одна из немногих микоплазм, у которых есть экстрахромосомные элементы.
Acholeplasma laidlawii – сободноживущий микроорганизм. Эта бактерия интересна тем, что по многим деталям своей физиологии занимает промежуточное положение между «нормальными» бактериями и «классическими» микоплазмами.

Текущие проекты группы

1. Выявление новых механизмов регуляции у клеток Mycoplasma gallisepticum при развитии инфекционного процесса в организме хозяина.
Малый объем генома и отсутствие жесткой клеточной стенки у микоплазм связаны с их паразитическим образом жизни и приближают их по характеристикам к
так называемой «минимальной клетке» – теоретическому организму, содержащему минимальный набор компонентов, необходимых и достаточных для независимого самовоспроизведения на искусственных питательных средах. Поскольку организация различных метаболических систем таких клеток лучше поддаётся описанию вследствие небольшого числа компонентов, микоплазмы являются удобным объектом для исследований в области системной биологии.
Помимо редукции генома для микоплазм характерна редукция известных систем регуляции экспрессии генов. Долгое время считалось, что все системы регуляции экспрессии генов у микоплазм подверглись редукции. В последнее время появились работы, в которых показано наличие регуляции экспрессии генов микоплазм, однако её механизм остаётся неизвестным. Метаболические возможности молликут также сильно редуцированы, большинство необходимых веществ они поглощают из среды. При этом микоплазмы обладают высокими адаптивными возможностями и способны, в частности, успешно противостоять антибиотикотерапии. В результате, исходя из геномной аннотации, микоплазмы имеют существенно ограниченные адаптивные возможности, с другой стороны на практике они очень велики. В связи с этим исследование адаптации микоплазм к стрессу представляет как теоретический, так и практический интерес.

Целью данной работы было исследование механизма адаптации Mycoplasma gallisepticum к стрессовым условиям на модели окислительного, осмотического и теплового стресса. Вследствие паразитического образа жизни Mycoplasma gallisepticum данные виды стресса являются для этой бактерии физиологическими, с которыми она сталкивается в результате ответа иммунной системы хозяина. В задачи данного исследования входило наиболее полное, системное исследование всех уровней адаптации этого микроорганизма.Такой подход, применённый в данной работе, включал в себя секвенирование генома, создание биологических моделей стресса, транскриптомный анализ в различных стрессовых состояниях и протеомный анализ выбранных состояний. Транскрипционное профилирование также включало разметку функциональных единиц, включая промоторы, опероны и некодирующие РНК. В результате картирования сайтов инициации транскрипции была построена модель промотора M. gallisepticum. Были обнаружены новые гены, задействованные в ответе на стрессовые условия. Было показано, что тепловой стресс приводит к потере клетками M. gallisepticum поверхностных антигенов, что может быть частью системы защиты от иммунного ответа хозяина.

2. Исследование механизмов взаимодействия микоплазм с внутриклеточными органеллами.
Для ряда микоплазм было показано, что они способны оказывать воздействие на развитие апоптоза в клетках-хозяина. В ряде работ была показана способность M.gallisepticum проникать внутрь эукариотических клеток. Способность M. gallisepticum к длительному внутриклеточному персистированию, а также ее участие в развитии апоптоза в клетке хозяина, может указывать на возможное влияние микоплазм на метаболизм клетки-хозяина и внутриклеточных органелл. В частности, особенный интерес для нас представляет исследование возможного взаимодействия микоплазмы с митохондриями и их влияния на запуск митохондриального пути апоптоза.

3. Разработка протоколов транскрипционного профилирования бактерий с применением технологий высокопроизводительного секвенирования.
Подготовка библиотек для секвенирования бактериальной РНК сопряжена с рядом трудностей, часть из которых обусловлена объектом исследования, а часть стоящими задачами. Качество получаемого результата зависит от целого ряда этапов в приготовлении библиотек, некоторые из которых не кажутся важными. При этом секвенирование бактериальной РНК само по себе накладывает ряд трудностей по сравнению с эукариотической РНК. Так, бактериальная мРНК не имеет поли-А концов, обогатить таким образом препарат тотальной РНК мРНК невозможно. Удаление рРНК с помощью гибридизации может приводить (и приводит) к искажению количественной представленности транскриптов. Метод фрагментации РНК может приводить к большей или меньшей неравномерности покрытия, что важно для картирования транскрипционных единиц и поиска некодирующих транскриптов.
В настоящее время разработаны протоколы фрагментации РНК и нормализации библиотек кДНК для направленного и ненаправленного секвенирования РНК с помощью секвенаторов SOLiD и IonTorrent. Технология приготовления библиотек, обогащённых 5`-концевыми последовательностями РНК. Методика мечения 5`- и 3`-концевых последовательностей РНК.

4. Разработка протоколов исчерпывающего, количественного протеомного анализа бактерий с использованием технологий MRM, SWATH и изотопных меток.
Количественный анализ с помощью масс-спектрометрии сопряжён с рядом трудностей, отсутствующих в случае, когда целью является идентификация белка. Во-первых, как и в случае транскриптомики, пробоподготовка сопряжена с фрагментацией образца – белка – с помощью протеазы (трипсина). При этом белки имеют сложную и компактную структуру, что вызывает стерические затруднения при протеолитическом расщеплении. Использование денатурирующего геля облегчает трипсинолиз, но может приводить к искажению количественной представленности пептидов в результате неэквимолярной экстракции. Вследствие этого был разработан метод трипсинолиза в растворе с использованием дополнительной протеазы. Количественный масс-спектрометрический анализ пептидов осложнён большой вариабильностью их физико-химических свойств. Вследствие этого любой пептид не подходит для анализа количественной представленности белка. При анализе сложных смесей, каковыми являются триптические лизаты клеток необходим способ однозначной идентификации пептида, для чего используется спектр его фрагментации (метод MRM). В результате был разработан протокол выбора и измерения представленности белков с помощью протеотипических пептидов и технологии MRM.

5. Исследования изменений метаболома бактерий класса Mollicutes (Mycoplasma gallisepticum, Acholeplasma laidlawi, Spiroplasma melliferum) под воздействием внешних факторов.
Развитие системной биологии подразумевает процесс интегрирования данных транксриптомики, протеомики, геномики и метаболомики для получения более целостного представления о живых организмах. Метаболомика- это систематическая идентификация и количестивенная оценка всех метаболических продуктов клетки, ткани, органа или организма под влиянием изменения внешних условий. Метаболом- это динамическая совокупность всех метаболитов, которая представляет собой метаболичекий отклик клетки или организма на текущее состояние. 1
Данные об экспрессии мРНК, расшифровка ДНК-последовательностей и данные протеомного анализа не раскрывают полностью всех процессов, происходящих в клетках. Выяснение состава метаболитов может дать новую информацию о процессах клеточной регуляции и механизмах возникновения мутаций в стрессовых состояниях у микроорганизмов с ограниченной емкостью генома.
В связи с различиями физико-химических свойств метаболитов чрезвычайно важно выбрать метод разделения с последующим анализом, дающие адекватные результаты. В метаболомике используют такие методы, как газовая и жидкостная хроматография капиллярный электрофорез, масс-спектрометрия высокого разрешения и др. Для анализа метаболитов мы используем ВЭЖХ-МС/МС метод и предварительное разделение компонентов метаболома на аналитической колонке с силикагельной сепарирующей фазой.
Молликуты, живущие в естественной среде обитания, постоянно подвергаются неблагоприятным внешним воздействиям (температура, изменение кислотности среды, антибиотики, голодание, осмос.) и активно приспосабливаются к ним, не смотря на редуцированные метаболические возможности. Исследование адаптации микоплазм к стрессу,как уже говорилось, представляет как теоретический, так и практический интерес.

В ходе работы над проектом мы реконструировали схему метаболизма исследуемых видов на основе данных геномного, протеомного и метаболомного анализа, а также провели сравнение метаболических профилей клеток Mycoplasma gallisepticum, Acholeplasma laidlawi, Spiroplasma melliferum в норме и при внешнем воздействии для выявления роли отдельных метаболитов в адаптации микоплазм.